SELEKSI DAN PENINGKATAN EKSPRESI GEN

SELEKSI DAN PENINGKATAN EKSPRESI GEN

·        Langkah awal  pengembangan proses bioteknologi adalah

Mencari organisme yang sesuai dengan tujuan untuk menghasilkan suatu produk atau jasa yang menguntungkan bagi industri.

·        Kalau dulu pemilihan organisme dapat dilakukan dengan sistim coba-coba sehingga memerlukan waktu yang lama dan menjemukan.

·         Teknologi yang baru seperti fusi protoplas dan penggunaan rekombinasi DNA dapat disiapkan organisme yang diinginkan untuk kepentingan bioteknologi.

·        Organisme industrial diharapkan dapat menunjukkan sebagian besar sifat sebagai berikut :

-         Sebaiknya sebagai suatu kultur yang murni

-         Sifat genetika yang stabil

-         Mudah dipropagasi

-         Menunjukkan karakteristik  pertumbuhan yang cepat

-         Memiliki kecepatan pembentukan produk yang baik

-         Bebas dari produk samping yang beracun

-         Dapat dimanipulasi secara genetika

Kultur yang digunakan dalam industri secara umum muncul melalui 3 tahap yaitu:

1.     Kultur Penelitian (dipelajari untuk mencari suatu produk yang berguna)

2.     Kultur Pengembangan (Suatu kultur penelitian yang sudah menunjukkan suatu kegunaan)

3.     Kultur Produksi ( Suatu kultur Penelitian yang sekarang benar-benar digunakan untuk produk industrial)

·        Seleksi  (Penyaringan ) merupakan penggunaan prosedur sangat selektif untuk mendeteksi dan mengisolasi hanya mikroorganisme atau metabolit yang diinginkan dari suatu populasi.

·         Rintangan utama dalam hal ini adalah ketersediaan prosedur penyaringan yang sesuai yang dapat mengidentifikasi produk yang diinginkan.

·        Mikroorganisme merupakan kelompok organisme utama yang kini dikembangkan untuk kepentingan bioteknologi.

·        Cara pendekatan yang digunakan untuk mencari mikroorganisme baru dari lingkungan untuk proses bioteknologi :

1.     Pendekatan Ekologi yang menyangkut:

Strategi :- Membuat pendataan isolat dari species yang dikenal

                - Memperkaya koleksi isolat

                - Menyelidiki habitat tidak umum

                - Mengembangkan teknik isolasi untuk species baru

Teknik Penghamburan : -Pengenceran tanah (Soil  dilution)

-Flotasi sedimentasi partikel dan percontohan      udara

                                          -Mengembangkan mikrohabitat

Selektif dan teknik pengayaan : - Substrat selektif

- Inhibitor selektif, Mis. Sikloheksamida,    dan rifampisin

                                         - Lingkungan fisik (suhu, pH)

2.     Pendekatan genetika

Strategi : - Menghasilkan mutan biosintesis yang sesuai untuk    pemasukan precursor

                     - Membuat galur hybrid untuk menghasilkan antibiotika.

- Penggunakan pengklonan gen untuk mengarah kembali biosintesis.

Teknik : -Mutasi dan seleksi

               -Rekombinasi dan konyugasi

               -Fusi protoplas

               -Siklus kapang, seksual dan paraseksual

     -Transformasi dan transduksi (memperbanyak dengan menggunakan protoplas.

-Pengklonan gen dengan pengklonan sasaran –terarah untuk  gen spesifik.

     -Pengklonan acak untuk menghasilkan koleksi gen.

Penyaringan dibedakan dalam 2 bentuk dasar :

1.     Penyaringan acak nonselektif :

-         Semua isolat diuji secara individual untuk memperoleh kualitas yang diingini.

-         Membutuhkan waktu yang sangat lama

-         Menggunakan peralatan yang lebih banyak.

2.     Penyaringan rasional:

-         Sebelumnya ada aspek praseleksi.

-         Lebih banyak menggunakan pengetahuan biokimia atas pembentukkan produk yang spesifik ( contoh : produksi antibiotika pada Cephalosporium acrenomium menunjukkan ada hubungannya dengan aktivitas enzim proteolitik Hal ini dapat digunankan sebagai dasar penyaringan.

·        Setelah memperoleh  mikroorganisme baru  harus disimpan dan dipelihara yang merupaka ciri menyeluruh dari infrastruktur bioteknologi.

·        Sebagian besar mikroorganisme industrial akan dipelihara dengan menggunakan salah satu prosedur sebagai berikut :

1.     Medium agar dengan pembuatan sub kultur yang teratur.

2.     Mengurangi metabolisme (Pelapisan dengan minyak mineral, pendinginan)

3.     Pengeringan (pasir pengering, gel silica, tanah atau kertas saring

4.     Pembekuan kering (penggunaanya lebih luas karena lebih sederhana serta memberikan stabilitas yang lebih tinggi)

5.     Pendinginan suhu rendah (-70^oC sampai –196^oC) merupakan metode yang lebih mahal dan cocok untuk berbagai jenis mikroorganisme

·        Tujuan Peynimpanan adalah

-         Supaya galur tersebut tetap hidup (viable)

-         Menghindari atau meminimalisasi penyimpangan galur (galur baru hasil manipulasi cendrung tidak stabil)

Peningkatan Ekspresi Gen Dapat Dilakukan dengan Modifikasi Genom Melalui :

1.     Mutagenesis

·        Merupakan sumber utama semua variasi genetic (Industrial)

·        Tujuan untuk meningkatkan produktivitas

·        Kesulitannya adalah mutasi terjadi pada frekwensi rendah dan harus diseleksi dari sejumlah basar populasi nonmutan

·        Contoh hasil mutasi adalah Galur Streptomyces → Tetrasiklin

·        Galur mutannya adalah S. aureofaciens S-604 mensintesis 6-dimetiltetrasiklin yang tidak dapat disintesis oleh galor inangnya.

·        Mutagen ada 2 yaitu : Fisik dan Kimia (mutagen penginduksi : tidak akibat kerusakan DNA, tapi lebih merupakan hasil perbaikan DNA seluler yg terjadi pada DNA yang rusak untuk menghslkan perubahan yang tetap pada urutan dasar DNA).

(Sinar UV, Radiasi ionisasi, dan mitomisin C, 5- bromurasil, metilmetan sulfonat, mustard nitrogen serta senyawa nitrofuran)

 

2.     Hibridisasi (Rekombinasi)

·        Menyusun ulang gen atau bagian gen  dari 2 atau lebih organisme dan Menggabungkan menjadi satu informasi genetika dalam satu organisme

·        Ada 2 jalan yaitu Hibridisasi seksual (Eukariot) dan paraseksual (Prokariot sampai Eukariot)

1. Hibridisasi Seksual

·         Inti haploid dari jenis kelamin berbeda bergabung dalam satu sel  (kariogami) membentuk inti diploid selajutnya mengalami miosis.

·         Selama miosis terjadi penyusunan ulang  dan reorganisasi kromosum yang mengakibatkan terjadi rekombinasi elemen genetik .

·        Jika organisme memiliki sejumlah n gen yang berbeda  maka rekombinasi terjadi sebanyak 2ⁿ genotip.

·        Contoh Hibridisasi galur ragi Saccharomyces yang berbeda → produksi roti secara cepat, menaikkan kandungan alkohol dsb.

2.Hibridisasi Paraseksual

·        Proses rekombinasi terjadi pada sel vegetatif

·        Contoh : Konjugasi, Transduksi, Transpormasi, Rekombinasi Mitosis, dan Fusi Protoplas.

·        Konjugasi : Proses transper informasi genetic dari satu sel ke sel lain melalui kontak antarsel.

Contoh: pada bakteri (bisa melalui plasmid / kasus tertentu bisa melibatkan Hfr dan galur elemen genetik ekstra)

Dua galur E. coli yang berbeda   dimana perpindahan genetik terjadi melalui filus sex  (berupa tabung yang dibentuk oleh salah satu dari pasangan sel. Sel yang membentuk filus mengandung elemen genetic ekstra , faktor F atau plasmid yang memegang peranan pada pemutusan DNA lingkar serta perpindahannya ke sel bakteri lain yang akan terjadi rekombinasi antara dua genom.

·        Transduksi : Perpindahan materi genetik dari satu sel ke sel lain dengan bantuan Vektor Virus yang diikuti secara rekombinasi.

·        Transpormasi : perpindahan materi genetic secara tidak terarah  (DNA yang berasal dari suatu sel diambil dan tetap dilindungi oleh sel lain)

Transpormasi dapat dikerjakan secara In – vitro atau manipulasi yang melibatkan mutagenesis sebelum dimasukkan kedalam sel.

·        Rekombinasi Mitosis : (berlaku pada Kapang yang memiliki fase vegetatif haploid, dimana sejumlah kecil inti dapat melebur untuk membentuk diploid).

Ada 3 tahap :

1.                           Pembentukan heterokarion (dua atau lebih inti yang berbeda dengan satu sitoplasma tunggal) antara dua miselia haploid

2.                           Peleburan inti oleh sejumlah kecil inti yang berlawanan yang mengakibatan pertukaran kromosum

3.                           Haploidisasi (inti diploid diubah menjadi menjadi haploid).

Diketahui rekombinasi mitosis jauh kurang efektif dibandingkan dengan rekombinasi seksual.

·  Fusi Protoplas : Meleburnya protoplas yang diikuti terbentuknya sel hibrid.

-         Induksi fusi protoplas mikroba berkembang sangat luas

-         Menggunakan secara mekanis dan enzimatis

-         Tapi kebanyakan dengan menggunakan enzim litik (contohnya : helikase, glusulase, sulfatase  untuk menghasilkan protoplas ragi).

-         Pada umumnya sel fase eksponensial lebih lebih mudah menghasilkan protoplas dari pada sel  fase stationer (komposisi dinding sel berubah selama siklus pertumbuhan)

-         Untuk menjaga stabilitas protoplasma yang dihasilkan diperlukan adanya stabilisator seperti: berbagai garam inorgenik, gula dan gula alkohol.

-         Protoplas dapat membentuk dinding sel yang baru selanjutnya sel akan tumbuh secara normal. Jika rekombinasi terjadi maka akan timbul organisme yang berubah secara genetik.

-         Baru-baru ini dikembangkan fusi protoplas dengan menggunakan medan listrik ( Sel diganggu dengan menggunakan medan listrik yang lemah tak homogen dan frekwensi tinggi sehingga sel membentuk cabang. Selajutnya dialirkan arus searah (DC) yang menyebabkan terbukanya mikropore dalam membran sehingga isi sel akan bergabung dan melebur.

-         Jika dua protoplas dari galur yang berbeda melebur maka dihasilkan sel  yang heterokariotik (mengandung inti yang berbeda sumber).

-         Peleburan inti dapat terjadi antara inti haploid dari genotip yang berbeda akan menghasilkan inti yang diploid heterozigot sedangkan dari inti yang sejenis akan menghasilkan inti diploid yang homozigot.

-         Aplikasi Impiris dari Fusi Protoplas dapat dilihat pada perbaikan hasil produksi antibiotik dan Fusi turunan dari sel manusia yang mampu menghasilkan insulin

-         Fusi Sel sudah berhasil diterapkan pada sel hewan untuk menghasilkan antibodi monoklonal.