Prosedur kerja Isolasi senyawa murni dari daun sukun

BAB III


METODE PENELITIAN






3.1. Jenis, Waktu dan Tempat Penelitian


Penelitian ini bersifat eksploratif dan eksperimental yang akan dilaksanakan selama 3 bulan dari bulan Maret-Mei 2013, bertempat di Laboratorium Kimia, FKIP, Universitas Mataram.


3.2. Alat dan Bahan


Peralatan yang digunakan terdiri dari penguap putar vakum (rotary evaporator vacum), erlenmeyer, gelas kimia, gelas ukur, pipet tetes, spatula, neraca analitik, gelas arloji, Mortar, Statif, Corong kaca, botol vial, Gelas Ukur, Gelas kimia, Penangas Air,Pipa kapiler, Tabung reaksi, peralatan kromatografi cair vakum (KCV), kromatografi kolom grafitasi (KKG), Kromatografi lapis tipis (KLT), dan peralatan spektroskopi UV, IR, GC-MS dan NMR.


Bahan Yang Digunakan dalam penelitian ini adalah daun sukun yang diperoleh dari daerah Narmada Lombok Barat. Pelarut-pelarut organik pure analis dan teknis yaitu metanol (p.a dan teknis), n-heksan (p.a dan teknis), Aseton (p.a dan teknis), Aquades, Plat KLT florosense berukuran 20 x 20 cm, Kertas saring, alumunium foil, kapas, silika gel G 60.





3.3. Prosedur Kerja


3.3.1. Preparasi Sampel


Sampel berupa daun sukun dibersihkan dan dipotong kecil-kecil agar daun cepat mengering kemudian dikering-anginkan di udara terbuka. Daun sukun yang sudah kering kemudian diremukan hingga menjadi remah dan serbuk halus.


3.3.2. Uji Pendahuluan


Uji pendahuluan dilakukan untuk mengetahui pelarut yang paling cocok pada proses maserasi sampel. Pada uji ini pertama-tama sampel yang telah menjadi serbuk disiapkan dalam tiga buah vial masing-masing sekitar 0,5 gr sampel, kemudian dilakukan ekstraksi maserasi dengan pelarut yang berbeda pada setiap vial. Pelarut yang digunakan adalah Metanol, Aseton, Aseton dan n-heksan. Selanjutnya dilakukan maserasi selama 1 x 1 jam. Masing-masing hasil maserasi kemudian disaring dan diuapkan hingga tersisa sedikit larutan pada vial. Filtrat kental masing-masing pelarut ditotolkan pada sebuah plat KLT dan di elusi dengan pelarut yang cocok. Diamati spot yang terbentuk pada Plat KLT dan tandai letak spotnya. Apabila spot tidak terlihat jelas maka spot dapat diamati dengan menyinari Plat KLT di bawah sinar UV pada panjang gelombang yang sesuai.


3.3.3. Ekstraksi Senyawa Aktif


Sebanyak 200 gr serbuk kering daun sukun diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut n-heksana p.a, selama 1 x 24 jam sehingga semua senyawa aktif dalam sampel terekstrak sempurna. Kemudian dilanjutkan dengan proses re-maserasi menggunakan aseton p.a selama 1 x 24 jam. Ekstrak aseton yang diperoleh dipekatkan dengan vacum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak aseton kental, dan ekstrak kental yang diperoleh ditimbang.


3.3.4. Pemisahan dan Pemurnian


Pemisahan senyawa pertama dilakukan dengan Uji KLT yang dilakukan menggunakan sistem campuran eluen menggunakan pelarut kloroform dan n-heksana dengan perbandingan 9:1. Hasil kromatogram diamati di bawah lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm agar dapat dilihat pola pemisahan komponen-komponen senyawanya. Pelarut yang menghasilkan pola pemisahan yang baik digunakan untuk proses pemisahan selanjutnya yaitu menggunakan kromatografi kolom dengan menggunakan pelarut yang ditingkatkan kepolarannya (5-100%). Hasil dari Kromatografi kolom ini akan menghasilkan beberapa fraksi yang selanjutnya fraksi-fraksi tersebut diuapkan dan dipisahkan dengan KLT dimana fraksi-fraksi yang sama akan digabungkan menjadi fraksi F1, F2, F3, F4, F5 dan seterusnya. Hasil penggabungan fraksi tersebut dimonitoring dengan KLT kembali untuk melihat pemisahannya setelah penggabungan.


· Skema kerja


- Tahap persiapan


a. Mengambil daun sukun segar dari pohon sukun di daerah lembar.


b. Menjemur daun sukun yang telah dikumpulkan di bawah sinar matahari selama ± 7 x 24 jam.


c. Daun sukun yang telah dikeringkan diremukan sehingga menjadi remah/serpihan dengan tujuan untuk memperluas permukaan sampel.


- Tahap percobaan (skala kecil)


a. Beberapa gram sampel direndam dalam 3 botol vial dengan 3 pelarut yang berbeda yaitu n-heksan, aseton dan methanol.


b. Sampel direndam selama ± 10 menit.


c. Untuk sampel n-heksan perendaman kemudian dilanjutkan dengan mengganti larutan n-heksan dengan larutan aseton pada sampel yang sama (remaserasi)


d. Selanjutnya ketiga sampel di KLT untuk melihat spot yang terbentuk dengan eluen Kloroform:n-heksan 9:1.


e. Dari spot KLT yang terbentuk kemudian diketahui pelarut yang paling mungkin untuk dilanjutkan pada percobaan skala besar.


- Tahap Pelaksanaan (Skala Besar)


a. 300gr sampel direndam dalam n-heksan selama ± 24 jam.


b. Sampel hasil rendaman diremaserasi dengan aseton selama ± 48 jam.


c. Larutan hasil rendaman disarin untuk memisahkan pengotor dan larutan sampel


d. Larutan sampel yang telah disaring kemudian dievaporasi hingga mendapatkan larutan kental.


e. Selama proses evaporasi, disiapkan pula silica gel dengan memanaskannya. Tujuan dari pemanasan silica gel adalah untuk menghilangkan pengotor pada silica gel.


f. Kemudian larutan kental hasil evaporasi dipanaskan untuk mendapatkan sampel dalam bentuk padatan/Kristal.


· Kromatografi Vacum Cair


a. Silica gel yang telah murni dipadatkan dalam tabung KVC kemudian setelah padat silica gel dicuci dengan larutan n-heksan.


b. Kemudian di atas padatan silica gel dituangkan padatan sampel yang telah dipanaskan secara merata, kemudian diatur agar posisi padatan tersebar merata dan mampat.


c. Selanjutnya sampel dielusi dengan DCM 100% 50ml sebanyak 3 kali.


d. Setelah dielusi dengan DCM 100% kemudian dilanjutkan dengan n-heksan 100% 50ml dilakukan sebanyak 3 kali.


e. Kemudian dilanjutkan dengan mengelusi sampel dengan eluen n-heksan:DCM 100% dengan perbandingan 1:9 sebanyak 50ml dan dilakukan sebanyak 3 kali.


f. Dari masing-masing hasil elusi ditampung dalam botol kaca 150ml.


g. Hasil dari sampel kemudian di KLT dengan untuk mengetahui yang paling mungkin dilanjutkan pada kromatografi kolom grafitasi.


h. Dari hasil yang diperoleh fraksi yang mungkin untuk dilanjutkan adalah fraksi dari eluen DCM 100% dan kemudian dilanjutkan pada KKG


· Kromatografi Kolom Grafitasi


a. Menyiapkan peralatan untuk KKG


b. Memanaskan silica gel untuk membersihkannya dari oksidan yang ada.


c. Selanjutnya silica gel dipadatkan pada tabung KKG


d. Fraksi hasil DCM 100% kemudian dipanaskan hingga menjadi Kristal dan dimasukan ke dalam kromatografi kolom grafitasi dan di elusi dengan n-heksan 100%


e. Hasil fraksi dari kormatografi kolom ditampung dalam botol vial hingga semua hasil DCM 100% terurai semua


f. Masing-masing fraksi yang ditampung dalam botol vial langsung diuji pada plat KLT untuk melihat spot Rf masing-masing fraksi


g. Berdasarkan spot Rf yang terbentuk fraksi no. 8-15 dianggap yang paling mungkin untuk dilanjutkan.


· Kromatografi Lapis Tipis


a. Berdasarkan hasil dari KKG yang memiliki Rf hampir sama adalah fraksi no. 8-15


b. Fraksi no. 8-15 kemudian disatukan dan diuji pada plat KLT dengan eluen n-heksana 100%


c. Hasil penotolan menunjukan satu spot yang terbentuk, hal ini menunjukan bahwa telah diperoleh senyawa murni.


d. Untuk memastikan kemurnian senyawa, fraksi kemudian diujikan dengan uji system 3eluen. Adapun eluen yang digunakan yaitu n-heksana, kloroform, dan methanol


e. Hasil uji 3 sistem eluen tetap menunjukan satu spot yang berarti telah berhasil diperoleh 1 senyawa murni.









Skema Kerja



3.4.1. Preparasi Sampel










· Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan


· dipotong kecil-kecil


· ditumbuk










3.4.2. Uji Pendahuluan



















· Dimasukkan dalam 3 buah Vial, masing-masing 0,25 gram sampel


· sampel 1 dimaserasi dengan metanol


· sampel 2 dimaserasi dengan aseton


· sampel 3 dimaserasi dengan n-heksan


· Masing-masing dimaserasi selama 1 jam.


· Hasil maserasi disaring


· Diuapkan


· ditotolkan pada plat KLT


· Dielusi dengan eluen metanol-kloroform (7:3).


· Diamati spot-spot yang terbentuk.






3.3.5. Ekstraksi Senyawa Aktif












· Dimaserasi dengan n-heksan p.a selama 1 x 24 jam


· Larutan n-heksana dibuang


· Dimaserasi dengan aseton p.a selama 1 x 24 jam


· Ekstrak disaring dan disatukan


· Dipekatkan dengan Rotary evaporator









3.3.6. Pemisahan dan Pemurnian












· Di uji KLT


· Difraksinasi dengan kromatografi kolom eluen 5-100%


· Dimonitoring dengan KLT


· Fraksi yang sama digabungkan










· Dimonitoring dengan KLT














· Difraksinasi dengan Kromatografi kolom eluen 5-100%


· Dievaporasi


· Dimonitoring dengan KLT


· Fraksi dengan Rf sama digabungkan


· Ditimbang






· Dimonitoring dengan KLT










· Dimonitoring dengan KLT 1 dimensi dan KLT 2 dimensi dengan campuran eluen berbeda

















DAFTAR PUSTAKA


Achmad, S.A. 1986. Kimia Organik Bahan Alam. Jakarta : Karunika Universitas Terbuka.


Asih, Astiti I. A. R. dan Setiawan, Adi . I M. 2008. Senyawa golongan Flavonoid pada Ekstrak n-butanol kulit batang bungur (lagerstroemia speciosa pers.). Bukit Jimbaran : FMIPA Universitas Udayana.


Fessenden, R.J., dan Fessenden, J. S.1999. Kimia Organik Jilid I. Alih Bahasa H.


Gritter, R.J., J.M. Bobbitt, A.E. Schwarting. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung : ITB.


Harborne, J.B. 1996. Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Alih bahasa Kosasih Padmawinata. Bandung : ITB, Hal 35-50.


Heyne, K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia, Departemen Kehutanan, Jakarta Indonesia.


Hostettman, K., M. Hostettman, A. Maston. 1995. Cara Kromatografi Preparatif Penggunaan pada Senyawa Bahan Alam. Alih bahasa Kosasih Padmawinata. Bandung : ITB. Hlm 27-34.


Ihsan, Nurul. 2000. Isolasi Senyawa Aglikon Flavonoid dalam Ekstrak Metanol dari Daun Benalu Advokat menggunakan Kolom Kromatografi Gravitasi dengan Elusi Landaian. Skripsi. Unila. Bandar Lampung. Hlm 8.


Indarto. 2009. Isolasi dan identifikasi senyawa fenolik dari Kulit akar tumbuhan Artocarpus dadah Miq. Skripsi. Bandar Lampung : Universitas Lampung.


Http://www.one.indoskripsi.com/2012/juli/02/10:41WIB.


Johnson, L.E., dan R. Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Alih bahasa Kosasih Padmawinata. . Bandung : ITB. 365 hlm.


Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Bandung : ITB. Hlm 1-113.


Martin, A, Swarbrick, J., dan Cammarata, A. 1983.Farmasi Fisik, edisi ke-3, 8,Penerjemah Yoshita. Jakarta : UI Press.


Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung : ITB.


Setijo Pitojo, 2001. Keluwih, seri budi daya. yogyakarta : kanisius